Trizol法提禽流感病毒protocol
Trizol法適用于人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。
1、 取雞胚尿囊液，加入5-10倍體積 Trizol液，混勻；
2、 室溫放置5分鐘，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒；
3、 取上層水相于一新的離心管，按每ml Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘；
4、 棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混勻，4℃下7500g離心5分鐘；
5、 重復(fù)第4步；
6、 小心棄去上清液，然后室溫干燥5-10分鐘，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度；
7、 然后將RNA溶于水中，放置10分鐘。
用TRIzol LS提取
應(yīng)用TRIzol LS提取病毒RNA
所提取物為血清、血液、細(xì)胞培養(yǎng)液、雞胚尿囊液等液體中的病毒。提取時(shí)盡量在人少時(shí)進(jìn)行，防止空氣中RNA酶的污染。所用一切物品也應(yīng)是無(wú)RNA酶的。
1.1 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol LS 500ul，充分混勻，室溫放置10min。
1.2 加入200ul的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管（溶液充分乳化，成乳白狀，無(wú)分相現(xiàn)象），室溫放置10min （由于氯仿沸點(diǎn)低、易揮發(fā)，振蕩時(shí)離心管可能爆開(kāi)，小心）。
1.3 離心 4℃、13000r/min、15min，取上層液相移入另一管（切忌吸動(dòng)白色中間相）。
1.4 加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10min。
1.5 離心 4℃、13000r/min、15min，（這時(shí)乍一看會(huì)發(fā)現(xiàn)管子里好像沒(méi)有東西，再仔細(xì)看看，會(huì)發(fā)現(xiàn)靠近管底的壁上有一星點(diǎn)的白色沉淀物，就是它了）用槍小心吸去所有上清。
1.6 1ml75%乙醇洗一遍，離心 4℃、8000r/min、10min，（這時(shí)又會(huì)發(fā)現(xiàn)管子沒(méi)東西了，不要擔(dān)心，有的，但是因?yàn)榱刻倏床灰?jiàn)罷了）用槍小心吸去所有上清，在超凈臺(tái)中干燥5min。
1.7 加入適量DEPC處理水。（如果材料來(lái)源豐富的話，加入的水量為下一步RT的total減去其他試劑的量；若要省著點(diǎn)用，則自己看著辦了，盡量不要加太多的水）。
1.8 建議立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇后凍存于－70℃，可保存一年；若加入DEPC水后則只能在－20℃保存1個(gè)月左右。
用異硫氰酸胍提取
提禽流感病毒的詳細(xì)步驟，可參考（我提過(guò)N次做定量PCR都沒(méi)問(wèn)題）：
2.加600ul異硫氰酸胍，然后加入對(duì)照和樣品，再加200ul氯仿，顛倒混勻
3.13000rpm離心15min
4.在第3步離心快結(jié)束時(shí)，另取同樣多eppendorf管，加入400ul -20度預(yù)冷的異丙醇
5.取第3步離心的上清（一定不要吸取到中間白色層，第3步離心結(jié)束往外拿的時(shí)候，管子盡量不要傾斜）轉(zhuǎn)移到第4步準(zhǔn)備的管中，顛倒混勻
6.13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體
7.加600ul 75％乙醇，顛倒數(shù)次以洗滌殘存異丙醇
7.13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體
8.4000rpm離心10sec，將管壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸干，室溫干燥2－3min（不可過(guò)分干燥，防止下一步RNA不溶解）
9.加入20ul DEPE水（加入depc的純水高壓后的水即為DEPE水），輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5sec，冰上保存?zhèn)溆茫?小時(shí)內(nèi)使用，以免RNA降解）
[注意]
1、 整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。
2、 加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個(gè)月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年
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